En France, la législation encadrant l’utilisation de l’antibiogramme est intrinsèquement liée à celle des antibiotiques dits « critiques ». En effet, la règlementation a été établie par le décret n° 2016-317 du 16 mars 2016, paru au Journal Officiel de la République Française le 18 mars 2016 et entré en vigueur le 1^er avril 2016. Ce décret établi un cadre « relatif à la prescription et à la délivrance des médicaments utilisés en médecine vétérinaire contenant une ou plusieurs substances antibiotiques d’importance critique », il concerne à la fois « vétérinaires ; pharmaciens d’officine ; fabricants d’aliments médicamenteux ; laboratoires d’analyses biologiques ».

Les substances antibiotiques d’importance critique sont définies par une liste de substances actives, par les articles L.5144-1-1 et R.5141-117-2 de l’arrêté du 18 mars 2016. Ces substances sont définies comme des « substances antibiotiques d’importance critique (…) dont l’utilisation doit être prioritairement préservée dans l’intérêt de la santé humaine et animale ».

Antibiotiques critiques en médecine vétérinaire

• Céphalosporines de 3ème génération :
  • Céfopérazone, Céftiofur, Céfovécine
• Céphalosporine de 4ème génération :
  • Céfquinome
• Fluoroquinolones :
  • Danofloxacine, Enrofloxacine, Marbofloxacine, Orbifoxacine et Pradofloxacine

Ainsi, ces antibiotiques ne doivent pas être utilisés en première intention sauf en absence d’une autre molécule efficace pour la prise en charge thérapeutique de l’infection bactérienne. Cependant, leur prescription doit être subordonnée « à la réalisation préalable d’un examen clinique », « à la réalisation préalable d’un examen complémentaire visant à identifier la souche bactérienne » et « à la réalisation préalable d’un examen complémentaire visant à démontrer la sensibilité de la souche bactérienne identifiée à cet antibiotique au moyen d’un test de sensibilité réalisé selon une des méthodes fixées par arrêté conjoint des ministres chargés de la santé et de l’agriculture » selon les articles L.5144-1-1 et R.5141-117-2 de l’arrêté du 18 mars 2016

Et en cas d’urgence ?

Néanmoins, en cas d’urgence (septicémie, choc toxique…), ceux-ci peuvent être prescrit en 1^ère intention selon le contexte clinique et épidémiologique, « lorsqu’il s’agit d’un cas aigu d’infection bactérienne pour laquelle un traitement avec d’autres familles d’antibiotiques serait insuffisamment efficace ». En parallèle, il a l’obligation de réaliser un antibiogramme. Toutefois, « dans un délai de quatre jours après la prescription, le vétérinaire adapte le traitement en fonction de l’évolution du contexte clinique et épidémiologique et des résultats des examens complémentaires portés à sa connaissance. »

Ainsi, en fonction des résultats d’analyses et de l’évolution clinique, l’antibiothérapie devra être adaptée. Les résultats de l’antibiogramme sont valables 3 mois pour la même affection du même animal ou animal du même site, avec une ordonnance valable 1 mois. Après ce délai, et en vue d’une prolongation du traitement, un examen clinique devra être fait. Les résultats de l’antibiogramme doivent être conservés pendant une durée de 5 ans.

Pour justifier la prescription d’un antibiotique critique, seul l’antibiogramme réalisé par la méthode des « disques » selon les normes NF U47-106 et NF U47-107 et la méthode de dilution en milieu liquide sont recevables par la réglementation, y compris pour les antibiogrammes réalisés en clinique vétérinaire par le praticien !

Étape 1 : Lecture des résultats

La lecture de l’antibiogramme est effectuée après incubation de 16 à 24h. La lecture des zones d’inhibition est réalisée à complète inhibition de la culture à l’œil nu, la gélose placée à environ 30 cm de l’œil. La mesure précise du diamètre de la zone d’inhibition en millimètres est réalisée avec un décimètre ou un pied à coulisse, mais un lecteur automatique peut aussi être utilisé.

Présence de colonies isolées ?

Bordures des zones d’inhibition floues ?

Étape 2 : Interprétation

Une fois le diamètre de la zone d’inhibition mesuré, celui-ci est reporté dans des abaques de valeurs de référence éditées par la CA-SFM. (https://www.sfm-microbiologie.org/2021/04/23/casfm-avril-2021-v1-0/) Ces tableaux regroupent les données permettant d’établir, à partir du diamètre de la zone d’inhibition, le statut d’une souche bactérienne vis-à-vis des antibiotiques testés.

Les souches sont catégorisées en :

• Souches dites « Sensibles », sont celles pour lesquelles la probabilité de succès thérapeutique est forte en cas de traitement systémique avec une posologie recommandée par le résumé des caractéristiques du produit (RCP).
• Souches dites « Résistantes » sont celles pour lesquelles un échec du traitement est fort probable.
• Souches dites « Intermédiaires » sont les souches pour lesquelles le résultat in vitro n’est pas prédictible de l’évolution thérapeutique : le succès ou l’échec thérapeutique est imprévisible. 

	Diamètre ∅ (mm)
Sensible	∅ ≥ D
Résistant	∅ < d
Intermédiaire	d ≤ ∅ < D

Exemple d’interprétation d’un antibiogramme :

Matériel

Pour réaliser un antibiogramme par la méthode des disques, il est nécessaire de disposer du matériel suivant :

• Une souche bactérienne en culture pure
• Un écouvillon stérile en coton
• Un tube à essai stérile de taille standard (Ø 16×160 mm – 18 mL)
• Géloses adaptées à la souche bactérienne : Mueller-Hinton, simple (MH) ou enrichie (MH-F)
• Un agitateur Vortex
• Un ensemenceur rotatif
• Un photomètre, ou à défaut les étalons 0,5 et/ou 1 de la gamme de McFarland
• Une feuille à fond strié
• Disques imprégnés du(des) antibiotique(s) testé(s)
• Un incubateur à 35°C
• Un décimètre ou un pied à coulisse

Étape 1 : Préparation de la souche bactérienne

La suspension bactérienne est préparée à partir d’une culture incubée 18 à 24h précédemment sur un milieu non-sélectif. Un écouvillon stérile en coton est utilisé pour prélever des colonies bactériennes de même morphologie, évitant la sélection d’un variant atypique. Les colonies sont ensuite émulsionnées dans une solution saline (NaCl 0,9%) et mélangées jusqu’à la turbidité requise (étalon 0,5 de la gamme MacFarland).

L’inoculum est utilisé idéalement dans les 15 minutes, et impérativement dans les 60 minutes suivant sa préparation.

Étape 2 : Choix de la gélose

Étape 3 : Inoculation de la gélose

L’ensemencement doit être réalisé sur des géloses ramenées à température ambiante et sèches. Si des gouttes d’eau sont visibles sur la gélose et/ou le couvercle de la boite, il est nécessaire de les sécher soit une nuit dans une pièce à 20-25°C, soit 15 min à 35°C. Les conditions d’asepsie doivent être assurées tout au long de la manipulation.

• Immerger l’écouvillon en coton stérile dans la suspension bactérienne (retirer l’excès de liquide en tamponnant l’écouvillon sur les bords internes du tube stérile)
• Ensemencer dans 3 directions différentes, décrit dans la figure suivante, ou bien à l’aide d’un ensemenceur rotatif.

Étape 4 : Sélection des disques

Les recommandations de la CA-SFM établissent par espèce, ou groupe bactérien, deux listes d’antibiotiques à utiliser lors de la réalisation d’un antibiogramme.

La première de ces listes représente les antibiotiques à utiliser pour un antibiogramme dit « Standard ». Ces molécules dépendent du couple bactérie/molécule et correspondent aux antibiotiques naturellement efficaces contre la souche bactérienne, et ce, d’après les mécanismes de résistance naturelle de cette espèce bactérienne. Cette liste comprend aussi des antibiotiques à spectre large et des antibiotiques à spectre étroit ayant la souche bactérienne dans leur spectre. La seconde liste représente des antibiotiques dits « Complémentaires ». Ceux-ci ont un intérêt épidémiologique, notamment celui de détecter des mécanismes de résistance. D’autres antibiotiques sont qualifiés « d’Equivalent ». En effet, ces molécules permettent de représenter tout un groupe d’antibiotiques.

Ces antibiotiques sont qualifiés de « Antibiotiques Marqueurs », ils permettent la détection de mécanismes de résistance plus ou moins marqués, car ce sont des molécules, qui, au sein d’un groupe d’antibiotiques, sont les plus affines pour ces mécanismes, et permettent donc leur mise en évidence.

Veuillez trouver pour chaque espèce bactérienne les disques d’antibiotiques de choix dans les recommandations de la CA-SFM sur le lien suivant : https://www.sfm-microbiologie.org/2021/04/23/casfm-avril-2021-v1-0/

Étape 5 : Dépôt des disques et intubation

Il est recommandé de laisser les disques atteindre la température ambiante de la pièce. Le dépôt des disques se fait à la main à l’aide d’une pince, ou bien grâce à un distributeur automatique de disques. Les disques doivent être en contact ferme avec la gélose et ne doivent pas être déplacés par la suite.

Il est important de limiter le nombre de disques présents sur une gélose, il est recommandé de disposer :

Attention ! Les disques d’érythromycine et de clindamycine doivent être placés à une distance de 12-20 mm bord à bord afin de détecter la résistance inductible aux lincosamides chez les Staphylocoques et les Streptocoques.

La mise en incubation doit se faire dans les 15 minutes suivant le dépôt des disques sur la gélose sans dépasser les 60 minutes. Pour les bactéries les plus courantes, il est nécessaire d’incuber les boîtes comme indiqué dans le tableau ci-dessous.

BRAVO ! L’antibiogramme est maintenant prêt à être lu !

Pour la suite de la démarche, il suffit de lire l’article DIY : Lire un antibiogramme.

Principe

L’antibiogramme a pour objectif de déterminer pour une souche d’une espèce bactérienne préalablement identifiée, sa sensibilité ou non à un ou plusieurs antibiotiques in-vitro. Il permet d’obtenir une mesure précise du niveau de sensibilité de la souche bactérienne en vue de prédire le succès ou l’échec thérapeutique in-vivo. Plus précisément, l’antibiogramme permet la mesure d’une concentration minimale inhibitrice (CMI), c’est-à-dire la plus faible concentration en antibiotique inhibant la croissance bactérienne, ou d’un diamètre d’inhibition, puis leur interprétation sur la base des référentiels fournis par des organisations nationales, européennes ou américaines.

• France : https://www.sfm-microbiologie.org/
• Europe : https://eucast.org/
• USA : https://clsi.org/

Différentes méthodes

Il existe différentes méthodes pour la réalisation d’un antibiogramme. Les méthodes basées sur la mesure de la CMI peuvent être déterminées en milieu solide ou liquide. En médecine vétérinaire, la méthode des disques est la plus répandue car plus adaptée au diagnostic de routine.

Une résistance à un antibiotique apparait lorsqu’ « une bactérie ne réagit plus de la même façon lors de l’utilisation d’antibiotiques prescrits pour traiter des infections bactériennes (infections urinaires, pneumonie, infections sanguines) et qu’ils deviennent alors inefficaces ».

Organisation Mondiale de la Santé (OMS)

L’antibiorésistance est devenue ces dernières années un enjeu mondial majeur en santé publique. En effet, l’émergence et la diffusion croissante de bactéries résistantes aux antibiotiques remettent en question l’efficacité des traitements tant chez l’homme que chez l’animal. Ce phénomène est fortement corrélé au mauvais usage ainsi qu’à la surconsommation des antibiotiques, il est aggravé par l’absence d’innovation dans le domaine depuis deux décennies, ce qui a conduit à une réduction de l’arsenal thérapeutique.

One health

Les antibiotiques sont la catégorie de molécules la plus utilisée par les vétérinaires. C’est pourquoi la lutte contre l’antibiorésistance doit aussi être considérée comme globale dans le concept d’une santé unique « One Health ». Tout comme en santé humaine, les échecs thérapeutiques secondaires à des bactéries résistantes aux antibiotiques augmentent de façon considérable au cours des dernières décennies.

Les plans d’action

L’antibiorésistance est considérée par l’OMS comme une des plus sérieuses menace pour la santé publique, imposant ainsi une approche globale de la Santé. Des plans d’action afin de lutter contre l’antibiorésistance ont vu le jour à différentes échelles. Ils sont résumés dans l’infographie ci-dessous.

L’antibiogramme s’inscrit aujourd’hui pleinement dans cette logique de détection et de surveillance de la résistance bactérienne, en identifiant les résistances et sensibilités de souches bactériennes impliquées dans les infections, et permettant ainsi un choix raisonné des molécules ayant une réelle efficacité, tout en préservant l’arsenal thérapeutique.